Изучение активности поли(АДФ-рибозо) полимеразы 1 методом флуоресцентной спектроскопии

Дата изготовления: июнь 2020 года. 

Цель работы – изучение активности поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 in vitro в реальном времени.

Задачи работы:

1. Разработка методики исследования активности PARP1 in vitro в реальном времени с помощью флуоресцентной спектроскопии и изучение активности PARP1 на модельных ДНК-субстратах.

2. Проверка возможности применения данного метода для быстрого скрининга ингибиторов PARP1.

3. Использование данного метода для изучения комплексообразования PARP1 с ферментами системы репарации ДНК и метаболизма поли(АДФ-рибозы).

4. Изучение влияния белкового фактора YB-1 на действие ингибиторов предложенным методом. 

5. Исследование активности PARP1 в присутствии нуклеосом

1. ВВЕДЕНИЕ 5

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7

2.1. Фермент поли(АДФ-рибозо)полимераза 1 и его роль в репарации ДНК 7

2.2. Ферменты, осуществляющие деградацию поли(АДФ-рибозы) 12

2.3. Ингибиторы PARP1 и их применение 13

2.4. Обзор существующих методов изучения активности PARP1 16

2.5. Изучение ферментов репарации с помощью измерения анизотропии флуоресценции 17

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 19

3.1. Хроматографическое выделение рекомбинантного PARP1 20

3.2. Хроматографическое выделение рекомбинантного NUDIX 16 21

3.3. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 21

3.4. Очистка и концентрирование рекомбинантных белков на центрифужном концентраторе «Vivaspin 6 мл» 22

3.5. Определение концентрации белка по методу Бредфорда 22

3.6. Отжиг ДНК-дуплексов 23

3.7. Электрофорез нуклеотидов в ПААГ 23

3.8. Проверка активности полученного рекомбинантного PARP1 с помощью [γ- P32]-NAD+ 23

3.9. Проверка активности полученного рекомбинантного NUDIX 16 с помощью [γ- P32]-NAD+ 24

3.10. Получение ДНК-фрагментов для реконструкции нуклеосом методом ПЦР 24

3.11. Проверка результатов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле 25

3.12. Реконструкция нуклеосом с помощью последовательных диализов 25

3.13. Нативный электрофорез нуклеосом в ПААГ 25

3.14. Изучение активности PARP1 на различных ДНК-субстратах методом флуоресцентной спектроскопии 26

3.15. Определение констант диссоциации PARP1 на разных ДНК-субстратах 27

3.16. Определение констант Михаэлиса и kcat PARP1 на разных ДНК-субстратах 27

3.17. Определение констант Михаэлиса и kcat PARP1 на разных ДНК-субстратах с использованием [β-H3]-NAD+ 28

3.18. Проверка разработанной тест-системы с ингибитором олапарибом 29

3.19. Определение типа ингибирования 7-метилгуанина для PARP1 30

3.20. Изучение взаимодействия PARP1 и YB-1 в присутствии ДНК 30

3.21. Изучение влияния YB-1 на действия олапариба 31

3.22. Изучение активности PARP1 после аутополи(АДФ-рибозил)ирования и обработки ферментами, деградирующими поли(АДФ-рибозу) 31

3.23. Изучение активности PARP1 в присутствии нуклеосом методом флуоресцентной спектроскопии 32

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 34

4.1. Получение ДНК-дуплексов с различными повреждениями 34

4.2. Получение рекомбинантного PARP1 35

4.3. Получение рекомбинантного NUDIX16 38

4.4. Активность PARP1 на различных ДНК-субстратах 40

4.5. Изучение действия ингибитора олапариба на PARP1 43

4.7. Взаимодействие PARP1 с YB-1 в присутствии ДНК 46

4.8. Влияние YB-1 на действие ингибитора олапариба 47

4.9. Связывание PARP1 c ДНК после аутополи(АДФ-рибозил)ирования и обработки NUDIX16 ферментами, деградирующими поли(АДФ-рибозу) 48

4.10. Получение нуклеосом in vitro 50

4.11. Изучение активности PARP1 в присутствии нуклеосом 52

5. ВЫВОДЫ 55

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 56

1.     Malanga M., Althaus F.R. The role of poly(ADP-ribose) in the DNA damage signaling network // Biochem. Cell Biol. – 2005. – V. 83. – P. 354–364.

2.     Lupo B., Trusolino L., Inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation in cancer: Old and new paradigm revisite // Biochimica et Biophysiaca Acta. – 2014. – V.1846(1). – P. 201–215.

3.     Langelier, M. F. et al. The Zn3 domain of human poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) functions in both DNA-dependent poly(ADP-ribose) synthesis activity and chromatin compaction // J. Biol. Chem. – 2010. – V.285. – P. 18877–18887.

4.     Ruf A. et al. Structure of the catalytic fragment of poly(ADP-ribose) polymerase from chicken // Proc. Natl. Acad. Sci. –1996. – V.93. – P.7481–7485.

5.     Langelier M.F., Planck J.L., Roy S., Pascal J.M. Crystal structures of poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) zinc fingers bound to DNA: structural and functional insights into DNA-dependent PARP-1 activity // J. Biol. Chem. – 2011. – V.286(12). – P. 1069.

6.     Rouleau M., Patel A., Hendzel M.J., Kaufmann S.H., Poirier G.G. PARP inhibition: PARP1 and beyond // Nat Rev Cancer. – 2010. – V.10(4). – P. 293–301.

7.     Tong W.-M., Cortes U., Wang Z.-Q., Poly(ADP-ribose) polymerase: a guardian angel protecting the genome and suppressing tumorigenesis // Biochim. Biophys. Acta. – 2001. – V.1552. – P. 27–37.

8.     Ray Chaudhuri A, Nussenzweig A, The multifaceted roles of PARP1 in DNA repair and chromatin remodelling // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2017. – V.18. – P. 610-621.

9.     Beck C. et al. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: focus on PARP1, PARP2 and PARP3 // Exp Cell Res. – 2014. – V.15. – P.18-25.

10. Kraus, W. L. Transcriptional control by PARP-1: chromatin modulation, enhancer-binding, coregulation, and insulation // Curr. Opin. Cell Biol. – 2014. – V.20. – P.294–302.

11. Scovassi A.I., Poirier G.G., Poly(ADP-ribosylation) and apoptosis // Mol. Cell. Biochem. – 1999. – V.199. – P.125–137.

12. Tallis M., Morra R., Barkauskaite E., Ahel I. Poly(ADP-ribosyl)ation in regulation of chromatin structure and the DNA damage response. // Chromosoma. – 2014. – V.123. – P. 79-90.

13. Gibson B.A., Kraus W.L. New insights into the molecular and cellular functions of poly(ADP-ribose) and PARPs // Nat Rev Mol Cell Biol – 2012. – V.20. – P.411-424.

14. Berger, F., Lau, C., and Ziegler, M. Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity by the phosphorylation state of the nuclear NAD biosynthetic enzyme NMN adenylyltransferase 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2007. – V.104. –P. 3765–3770.

15. Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., and Kraus, W. L. Reciprocal binding of PARP-1 and histone H1 at promoters specifies transcriptional outcomes // Science. – 2008. – V.319. – P.819–821.

16. Ju, B. G., Solum, D., Song, E. J., Lee, K. J., Rose, D. W., Glass, C. K., and Rosenfeld, M. G. Activating the PARP-1 sensor component of the groucho/ TLE1 corepressor complex mediates a CaMKinase II –dependent neurogenic gene activation pathway // Cell. – 2004. – V. 119. – P. 815–829.

17. Yu, W. et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation // Nat. Genet. – 2004. – V.36. – P. 1105–1110.

18. Суханова М.В., Лаврик О.И, Ходырева С.Н. Поли(АДФ-рибозо)полимераза1 – регулятор белково-нуклеиновых взаимодействий в процессах, возникающих при генотоксическом воздействии // Молекулярная биология. – 2004. – V.5. – С. 834–847.

19. Wei H., Yu X. Functions of PARylation in DNA Damage Repair Pathways // Genomics Proteomics Bioinformatics. – 2016. – V.14. – P. 131-139.

20. Purohit N.K., Robu M., Shah R.G., Geacintov N.E., Characterization of the interactions of PARP-1 with UV-damaged DNA in vivo and in vitro // Sci Rep. – 2016. – V.12. – P. 1-11.

21. Малюченко Н.В., Кулаева О.И., Котова Е.А., Чупыркина А.А., Никитин Д.В., Кирпичников М.П., Студитский В.М. Механизмы регуляции транскрипции поли(АДФ-рибозо)полимеразой 1 (PARP1) // Молекулярная биология. – 2015. – V.49(1). – С. 99–113.

22. Разин С.В., Быстрицкий А.А. Хроматин. Упакованный геном – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 176 с.

23. Althaus F.R., Kleczkowska H.E., Malanga M., Muntener C.R., Pleschke J.M., Ebner M., Auer B. PolyADP-ribosylation: a DNA break signal mechanism // Mol. Cell Biochem. – 1999. – V.193. – P. 5–11.

24. Griesenbeck J., Oei S.L, Mayer-Kuckuk P., Ziegler M., Buchlow G., Schweiger M. Protein-protein interaction of the human poly(ADP-ribosyl)transferase depends on the functional state of the enzyme // Biochemistry. – 1997. – V.36. – P. 7297–7304.

25. Crawford K., Bonfiglio J., Mikoc A., Matic I., Ahel I. Specificity of reversible ADP-ribosylation and regulation of cellular processes // Crit. Rev. Biochem. Mol Biol. – 2018. – V. 53. – P. 64–82.

26. Sharifi R., Morra R., Appel C.D., Tallis M., Chioza B., Jankevicius G., Simpson M.A., Matic I., Ozkan E., Golia B., et al. Deficiency of terminal ADP-ribose protein glycohydrolase TARG1/C6orf130 in neurodegenerative disease // EMBO J. – 2013. – V. 32. – P.

27. Moss J., Stanley S.J., Nightingale M.S., Murtagh J.J., Jr., Monaco L., Mishima K., Chen H.C., Williamson K.C., Tsai S.C. Molecular and immunological characterization of ADP-ribosylarginine hydrolases // BiolChem. – 1992. – V. 267. – P. 10481–10488.

28. Palazzo L., Thomas B., Jemth A.S., Colby T., Leidecker O., Feijs K.L., Zaja R., Loseva O., Puigvert J.C., Matic I., et al. Processing of protein ADP-ribosylation by NUDIX hydrolases // Biochem. – 2015. – V. 468. – P. 293–301.

29. Sonnenblick A., de Azambuja E., Azim H.A. Jr., Piccart M. An update on PARP inhibitors—moving to the adjuvant setting. // Nat. Rev. Clin. Oncol. – 2015. – V.12(1). – P. 27–41.

30. Anders, C. K. et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition: ‘targeted’ therapy for triple-negative breast cancer // Clin. Cancer Res. – 2010. – V.16. – P. 4702–4710.

31. Virag, L., Szabo, C. The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors // Pharmacol. Rev. – 2002. – V.54. – P.375–429.

32. Fong, P. C. et al. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers // N. Engl. J. Med. – 2009. – V.361. – P.123–134.

33. Tutt, A. et al. Oral poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and advanced breast cancer: a proof of concept trial // Lancet. –2010. – V.376. – P.235–244.

34. Tentori L., Portarena I., Graziani G., Potential clinical applications of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors // Pharmacol. Res. – 2002. – V.45. – P.73–85.

35. Cosi C., New inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase and their potential therapeutic targets // Expert Opin. Ther. Patents. – 2002. – V.12. – P.1047–1070.

36. Patel, A. G., De Lorenzo, S. B., Flatten, K. S., Poirier, G. G. & Kaufmann, S. H. Failure of iniparib to inhibit poly(ADP-Ribose) polymerase in vitro // Clin. Cancer Res. – 2012. – V.18. – 1655–1662.

37. Patel, A. G., Sarkaria, J. N. & Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADPribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 2011. – V.108. – P. 3406–3411.

38. Kraus W.L., Hottiger M.O. PARP-1 and gene regulation: progress and puzzles // Molecular Aspects of Medicine. – 2013. – V.34. – P. 1109–1123.

39. Shimizu S.N., Tomonaga F.T., Sunaga M., Noda M., Ebara M., Saisho H. Expression of poly(ADP-ribose) polymerase in human hepatocellular carcinoma and analysis of biopsy specimens obtained under sonographic guidance // Oncol. Rep. – 2004. – V.12. – P. 821–8.

40. Michels J., Galluzzi L., Adam J., Olaussen K.A., Kepp O., Senovilla L., Talhaoui I., Guegan J., Enot D.P. Cisplatin resistance associated with PARP hyperactivation // Cancer Res. – 2013. – V.73. – P. 2271–2280.

41. Cazzalini O., Dona F., Savio M., Tillhon M., Maccario C., Perucca P., Stivala L.A., Scovassi A.I., Prosperi E. p21CDKN1A participates in base excision repair by regulating the activity of poly(ADP-ribose) polymerase-1 // DNA Repair. – 2010. – V.9. – P. 62.

42. Milam K.M., Cleaver J.E. Inhibitors of poly(adenosine diphosphate-ribose) synthesis: effect on other metabolic processes // Science. – 1984. – V.223(4636). – P. 589–591.

43. Banasik M., Komura H., Shimoyama M., Ueda K. Specific inhibitors of poly(АДФ-ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase // J. Biol. Chem. – 1992. – V.267. – P. 1569–1575.

44. Farmer H., McCabe N., Lord C.J., Tutt A.N., Johnson D.A., Richardson T.B., Santarosa M., Dillon K.J., Hickson I., Knights C., Martin N.M., Jackson S.P., Smith G.C., Ashworth A., Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strateg.

45. Domagala T., Lubinski J., Gugala K., Domagala W. PARP-1 expression in breast cancer including BRCA1-associated, triple negative and basal-like tumors: possible implications for PARP1 inhibitor therapy // Breast Cancer Res. Treat. – 2011. – V.127. – P. 861.

46. McCabe N., Turner N.C., Lord C.J., Kluzek K., Bialkowska A., Swift S., Giavara S., O'Connor M.J., Tutt A.N., Zdzienicka M.Z., Smith G.C., Ashworth A. Deficiency in the repair of DNA damage by homologous recombination and sensitivity to poly(ADP-ribose) polymerase inhibition // Cancer Research. – 2006. – V.66. – P. 8109–8115.

47. Jagtap P., Szabo C. Poly(АDP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors // Nat. Rev. Drug Discov. – 2005. – V.4. – P.421–440.

48. Kaufmann S.H., Charron M., Burke P.J., Karp J.E. Changes in topoisomerase I levels and localization during myeloid maturation in vitro and in vivo // Cancer Res. – 1995. – V.55. – P. 1255–1260.

49. Nilov D.K., Tararov V.I., Kulikov A.V., Zakharenko A.L., Gushchina I.V., Mikhailov S.N., Lavrik O.I., and Švedas V.K.. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase by nucleic acid metabolite 7-methylguanine // Acta Naturae. - 2016. - V. 2 (29). - P. 108-115.

50. Zaffini R, Gotte G, Menegazzi M. Asthma and poly(ADP-ribose) polymerase inhibition: a new therapeutic approach // Drug Des Devel Ther. - 2018. - V. 12. - P. 281-293.

51. Zhang T., Berrocal J.G., Yao J., DuMond M.E., Krishnakumar R., Ruhl D.D., Ryu K.W., Gamble M.J., Kraus W.L. Regulation of Poly(ADP-ribose) Polymerase-1-dependent Gene Expression through Promoter-directed Recruitment of a Nuclear NAD Synthase // J. Biol. Chem. – 2012. – V.287(15). – P. 12405–12416.

52. Zhang J. Use of biotinylated NAD to label and purify ADP-ribosylated proteins // Methods Enzymol. – 1997. – V.280. – P. 255–265.

53. Putt K.S., Hergenrother P.J., An enzymatic assay for poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) via the chemical quantitation of NAD+: application to the high-throughput screening of small molecules as potential inhibitors // Anal Biochem. – 2004. – V.326. – P. 78–86.

54. Weber G., Rotational Brownian motion and polarization of the fluorescence of solutions // Adv. Protein Chem. – 1953. – V.8. – P. 415–459.

55. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A. Laboratory Manual – N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. – 1989. – 1885 p.

56. Hengen, P. Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli // Trends in Biochemical Sciences. – 1995. – V.20(7). – P. 285–286.

57. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – V.227. – P. 68–685.

58. Yasumitsu H., Ozeki Y., Kawsar S. M., Fujii Y., Sakagami M., Matuo Y., Toda T., Katsuno H. RAMA stain: a fast, sensitive and less protein-modifying CBB R250 stain // Electrophoresis. – 2010. – V.3. – P. 1913–1917.

59. Bradford M., Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – V.72. – P. 248–254.

60. Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro // Nucleic Acids Res. – 1990. – V.18(21) . – P. 6409–6412.

61. Rickwood D., Hames B.D. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach – Oxford: IRL Press at Oxford University Press. – 1990. – 311 p.

62. Thåström A , Bingham LM , Widom J. Nucleosomal locations of dominant DNA sequence motifs for histone-DNA interactions and nucleosome positioning // Journal of Molecular Biology. - 2004. - V. 338. - P. 695-709.

63. Lundblad J.R., Laurance M., Goodman R.H. Fluorescence polarization analysis of protein-DNA and protein-protein interactions // Mol. Endocrinol. – 1996. – V.10(6). – P. 607–12.

64. Michaelis L., Menten M.L., Johnson K.A., Goody R.S. The original Michaelis constant: translation of the 1913 Michaelis-Menten paper // Biochemistry. – 2011. – V.50(39). – P. 8264–8269.

65. Лаврик О.И., Дырхеева Н.С. Основы ферментативного катализа - Новосибирск: Редакционно-издательский центр НГУ. - 2012. - 97с.

66. Hasegawa S.L., Doetsch P.W., Hamilton K.K., Martin A.M., Okenquist S.A., Lenz J., Boss J.M. DNA binding properties of YB-1 and dbpA: binding to double-stranded, single-stranded, and abasic site containing DNAs // Nucl. Acids Res. – 1991. – V.19(18). – P.

67. Izumi H., Imamura T., Nagatani G., Ise T., Murakami T., Uramoto H., Torigoe T., Ishiguchi H., Yoshida Y., Nomoto M., Okamoto T., Uchiumi T., Kuwano M., Funa K., Kohno K. Y box-binding protein-1 binds preferentially to single-stranded nucleic acids and exh.

68. Gaudreault I., Guay D., Lebel M. YB-1 promotes strand separation in vitro of duplex DNA containing either mispaired bases or cisplatin modifications, exhibits endonucleolytic activities and binds several DNA repair proteins // Nucl. Acids Res. – 2004. – V.

69. Okamoto T., Izumi H., Imamura T., Takano H., Ise T., Uchiumi T., Kuwano M., Kohno K. Direct interaction of p53 with the Y-box binding protein, YB-1: a mechanism for regulation of human gene expression // Oncogene. – 2000. – V.19(54). – P. 6194-202.

70. Ise T., Nagatani G., Imamura T., Kato K., Takano H., Nomoto M., Izumi H., Ohmori H., Okamoto T., Ohga T., Uchiumi T., Kuwano M., Kohno K. Transcription factor Y-box binding protein 1 binds preferentially to cisplatin-modified DNA and interacts with prolif.

71. Marenstein D.R., Ocampo M.T., Chan M.K., Altamirano A., Basu A.K., Boorstein R.J., Cunningham R.P., Teebor G.W. Stimulation of human endonuclease III by Y box-binding protein 1 (DNA-binding protein B). Interaction between a base excision repair enzyme and.

72. Das S., Chattopadhyay R., Bhakat K.K., Boldogh I., Kohno K., Prasad R., Wilson S.H., Hazra T.K. Stimulation of NEIL2-mediated oxidized base excision repair via YB-1 interaction during oxidative stress // Biol. Chem. – 2007. – V. 282(39). – P. 28474-84.

73. Chattopadhyay R., Das S., Maiti A.K., Boldogh I., Xie J., Hazra T.K., Kohno K., Mitra S., Bhakat K.K. Regulatory role of human AP-endonuclease (APE1/Ref-1) in YB-1-mediated activation of the multidrug resistance gene MDR1 // Mol. Cell Biol. – 2008. – V. 2.

74. Lasham A., Moloney S., Hale T., Homer C., Zhang Y.F., Murison J.G., Braithwaite A.W., Watson J. The Y-box-binding protein, YB1, is a potential negative regulator of the p53 tumor suppressor // Biol. Chem. – 2003. – V.278(37). – P. 35516-23.

75. En-Nia A., Yilmaz E., Klinge U., Lovett D.H., Stefanidis I., Mertens P.R. Transcription factor YB-1 mediates DNA polymerase alpha gene expression // Biol. Chem. – 2005. – V. 280(9). – P. 7702-11.

76. Елисеева И.А., Ким Е.Р., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П.,тЛябин Д.Н. Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) и его функции // Успехи биол. хим. – 2011. – V. 51. – P. 65-132.

77. Kohno K., Izumi H., Uchiumi T., Ashizuka M., Kuwano M. The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-1 // Bioessays. – 2003. – V. 25(7). – P. 691-8.

78. Koh S.H. et al. The effect of PARP inhibitor on ischaemic cell death, its related inflammation and survival signals // Eur J Neurosci. - 2004. - V. 20. - P. 1461-1472.

79. Lowary P.T., Widom J.New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning // Journal of Molecular Biology. - 1998. - V. 276. - P. 19-42.